A.
引物长度: 15-30bp,常用为20bp左右。
B.
引物扩增跨度: 以200-500bp为宜,特定条件下可扩增长至10kb的片段。
C.
引物碱基:G+C含量以40-60%为宜,G+C太少扩增效果不佳,G+C过多易出现非特异条带。ATGC最好随机分布,避免5个以上的嘌呤或嘧啶 核苷酸的成串排列。
D.
避免引物内部出现二级结构,避免两条引物间互补,特别是3'端的互补,否则会形成引物二聚体,产生非特异的扩增条带。
E.
引物3'端的碱基,特别是最末及倒数第二个碱基,应严格要求配对,以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败。