A.
引物长度 15-30bp ,常用为 20bp 左右
B.
引物扩增跨度以 200-500bp 为宜,特定条件下可扩增长至 10kb 的片段
C.
引物碱基 G+C 含量以 40-60% 为宜, G+C 太少扩增效果不佳, G+C 过多易出现非特异条带。 ATGC 最好随机分布,避免 5 个以上的嘌呤或嘧啶 核苷酸的成串排列
D.
避免引物内部出现二级结构,避免两条引物间互补,特别是 3' 端的互补,否则会形成引物二聚体,产生非特异的扩增条带。
E.
引物 3' 端的碱基,特别是最末及倒数第二个碱基,应严格要求配对,以避免因末端碱基不配对而导致 PCR 失败。