双位点一步法是在双抗体夹心法的基础上进一步发展起来的，测定时将含待测抗原标本和酶标抗体同时加入进行反应，两种抗体互不干扰，经过一次温育和洗涤后，即可加入底物进行显色测定。但当待测抗原浓度过高时，过量的抗原可分别同固相抗体和酶标抗体结合而抑制夹心复合物的形成，出现钩状效应(hook effect)，显色降低，严重时可出现假阴性结果。必要时可将标本经过适当稀释后重复测定。

邻苯二胺灵敏度高，比色方便，是ELISA中应用最早的底物，但稳定性差，反应过程需要避光，还具有致癌性；四甲基联苯胺稳定性好，反应无需避光，没有致突变作用，是目前应用最广泛的底物，但是水溶性差。

HRP最敏感的色原底物，在HRP的作用下显橙黄色，加强酸如硫酸或盐酸终止反应后呈棕黄色，最大吸收峰在492nm波长。其反应液稳定性差，易变色，需在配置后1小时内使用，显色反应过程需避光，且具有致癌性。4-甲基伞酮基-R-D半乳糖苷（4-MUU）常用作β-半乳糖苷酶（β-Gal）的底物，酶作用后生成高强度荧光物4-甲基伞形酮（4-MU），测量时需用荧光剂。TMB经HRP作用后变为蓝色，加入硫酸终止反应后变为黄色，最大吸收峰波长为450nm。对-硝基苯磷酸酯经AP作用后产物为黄色对硝基酚，最大吸收峰波长为405nm。

标记酶应该具有酶活性高；可与抗原、抗体结合的基团；纯度及比活性高；酶催化底物后的成色信号易判断。

酶免疫技术均相和异相的分类是根据是否需要分离结合及游离标记物。

检测抗原常用双抗体夹心法检测。

间接法由于采用的酶标抗体仅针对一类免疫球蛋白分子，通常用的都是抗人IgG，严格地讲，所测的仅为抗体的IgG类，不涉及IgA和IgM类。此法由于受血清中高浓度的非特异性IgG的干扰，通常待测标本需经一定稀释后才能测定。

间接法标记抗体，具有种属内的通用性。

捕获法又称反向间接法，主要用于血清中某种抗体亚型成分(如IgM)的测定，目前是最常用的检测病原体急性感染诊断中的IgM型抗体。