作为标记的荧光素应具有能与蛋白质分子形成共价键的化学基团,与蛋白质结合后不易解离。
免疫荧光技术中,直接法可以用于检测抗原,而间接法除了可以检测抗原外,还可以检测抗体,如抗核抗体的检测。
流式细胞仪采集的前向散射光信号反映细胞的大小,侧向角散射光反映细胞表面的光滑程度和细胞内部结构的复杂程度。
由于荧光物质的量子效率极低,要有一个很强的激发光源,通常用高压汞灯、氙灯或卤素灯作为激发光源。
在制作标本过程中应力求保持抗原的完整性,并在染色、洗涤和封埋过程中不发生溶解和变性,也不会扩散至临近细胞或组织间隙中去。标本切片要求尽量薄些,以利抗原抗体接触和镜检。组织材料可制备成石蜡切片或冷冻切片。细胞或细菌可制成涂片,涂片或印片制成后应迅速吹干、封装,置-10℃保存或立即使用。
标本的特异性荧光强度一般用"+"表示,"-"为无或仅见极微弱荧光;"+"为荧光较弱但能清楚可见;"++"为荧光明亮;"+++"为耀眼的强荧光。
荧光偏振免疫测定的灵敏度较非均相荧光免疫测定法低。
荧光素结合到蛋白上的量的重要指标是荧光素与蛋白质的结合比率(F/P)。其计算方法是:FITC标记的荧光抗体稀释至A280nm约为1.0,分别测定A280nm和A495nm的值。F/P比值越大,表明抗体分子结合的荧光素越多,反之则结合越少。一般用于组织切片的荧光抗体染色以F/P=1.5为宜,用于活细胞染色以F/P=2.4为宜。
紫外光的波长范围是200~400nm。